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超速离心机的操作及超速离心技术的应用

    摘要:以贝克曼公司的Optima L-100xp超速离心机为例,论述了超速离心机的操作规程、使用注意事项及相关离心技术,可为离心机管理人员的管理和实验人员正确使用离心机提供有用的参考,有利于发挥离心机的最大使用效率,以满足医学和生命科学等相关专业实验人员的实验需要,为实验室的建设发挥更大作用。
    关键词:超速离心机 操作规程 离心技术
    中图分类号:R-331 文献标识码:A 文章编号:1001-7585(2013)16-2144-03
    超速离心机是生物医学实验室和医院最常用的科研仪器之一,它可以通过高速旋转产生的离心力场对具有不同沉降系数、质量和密度的混合物进行快速分离、浓缩和纯化[1]。超速离心机作为一种常用的实验手段,具有许多优点。例如可在低温下进行离心,这保证了生物大分子的活性不被破坏;制备型超速离心机的负载量大,一次可分离提纯几克样品,远大于层析和电泳的上样量。因此超速离心技术在医学、生命科学等相关专业研究中占有重要地位,是分离纯化病毒、亚细胞组份、蛋白质、RNA和质粒DNA等的最方便高效的实验技术之一[2]。
    1 超速离心机的基本操作
    (1)电源开启:打开电源,待离心机的显示器显示出正常的操作界面;(2)装入样品:将装有样品的离心管放入相应的角转子中或水平转子的吊桶中,将吊桶悬挂在水平转子上;(3)放置转子:双手握紧转子边缘将转子提起,对准离心机转轴轻轻放置,确认放好后,关上仓门;(4)设置参数:在显示器操作界面上选择所用转子的型号,离心转速,离心时间及离心温度,按“Download”键确认并回到主界面;(5)开始离心:在主界面上按“Precool”键预冷,当界面显示的温度达到设定温度后,按“Ente”键和“Start”键开始离心;(6)离心结束:当离心机蜂鸣器提示离心结束时,按“Vacuum”键使离心仓从真空状态恢复到正常气压;(7)收集样品:打开仓门,取出转子和离心管,再从离心管中收集目标区带;(8)关闭离心机:用软布擦拭转子和吊桶,关上仓门,最后关闭电源;(9)登记信息:在专用登记本上记录本次离心机使用的相关信息。
    2 超速离心机操作注意事项
    超速离心机转速较高,产生的离心力大,使用不当或缺乏定期的检修和保养,都可能发生严重事故,因此使用离心机时必须严格遵守操作规程。下面是超速离心机操作中的注意事项:(1)进行超速离心前,必须事先在电子天平上平衡离心管及其内容物,平衡时重量差不得超过转子的允许差值;转子中绝不能装载奇数的离心管,当转子只是部分装载时,离心管必须互相对称地放在转子中,以便使负载均匀地分布在转子的周围。(2)装载样品时,根据样品的性质及体积选用适合的离心管,样品装的过少,离心时塑料离心管的上部容易凹陷变形,样品装得过多,离心时又会甩出离心管,造成转子不平衡、生锈或被腐蚀,所以以样品装满离心管但不会溢出为原则。(3)样品要在低于室温的温度下离心时,转子在使用前应放置在冰箱或置于离心机的离心仓内预冷。(4)每个转子各有其最高允许转速和使用累积限时,使用转头时须查阅说明书,不得过速使用。每个转子都要配备一份使用档案,记录累积的使用时间,若超过了该转子的最高使用限时,则须按规定降速使用。(5)离心过程中不得随意离开,应随时观察离心机显示器上的数据是否正常,如有异常的声音应立即停机检查,及时排除故障。(6)每次使用后,必须仔细检查转子和吊桶,并及时清洗、擦干,转子是离心机的重要部件,搬动时要小心,不能碰撞,避免造成伤痕。
    3 超速离心分离技术的应用
    超速离心分离技术在应用上可分为制备型超速离心和分析型超速离心,本文将着重叙述制备型超速离心技术的应用。制备型超速离心是浓缩与纯化各种颗粒的最常用方法,依据被沉降颗粒的S值与ρ值特性不同,具体可分为下述几种方法:
    3.1 差速沉降离心法 
    主要用于组织匀浆液中分离沉降系数相差较大的细胞器的浓缩和粗提。此法是依据各种颗粒的质量、形状和大小等不同,即S值不同,在同一离心加速度作用下,沉降速度上存在着快慢差异而得到分离的。它适用于纯化颗粒间S值相远,沉降系数差异较大的那些颗粒。
    差速离心首先要选择好颗粒沉降所需的离心力和离心时间。当以一定的离心力在一定的离心时间内进行离心时,在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀,分出的上清液在加大转速下再进行离心,又得到第二部分较大较重颗粒的沉淀及含较小和较轻颗粒的上清液,如此多次离心处理,即能把液体中的不同颗粒较好地分离开。此法所得的沉淀是不均一的,仍杂有其他成分,需经过2~3次的再悬浮和再离心,才能得到较纯的颗粒。
    例如分离某种组织匀桨通过逐级增加离心加速度和离心时间,使各种不同的颗粒依次沉降。沉降顺序首先是整个细胞和组织碎片,其次是核、线粒体、溶酶体、微粒体,最后是核蛋白体及某些大分子。如图1所示。
   
    差速离心的优点是操作简易,离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开,并可使用容量较大的角式转子。缺点是须多次离心,沉淀中有夹带,分离效果差,不能一次得到纯颗粒,沉淀于管底的颗粒受挤压,容易变性失活。此法应用时应注意以下几点:(1)根据不同的实验目的(如保存形态还是保存活性),选择适宜的裂解方法,才有利于各种成分的纯化分离。(2)要注意根据所需转数的不同,分级使用离心机,低速能解决的问题不要用高速和超速离心机去解决,这样既能保证效果又能节省时间和避免高档离心机使用寿命的无谓损耗。(3)要认真地掌握离心时间和速度,否则时间过长或转数过高会使不该沉降的颗粒也沉降下来,而达不到分离纯化的目的。
    3.2 密度梯度离心法 
    密度梯度区带离心法是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡,在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上,形成不同区带的分离方法。此方法主要依据颗粒与介质间的密度差(ρ-ρ0)不同进行分离的。适用于那些沉降系数相差不大而密度值却有明显差别的颗粒,也就是那些S值相近而ρ值相远的颗粒。惰性梯度介质在本法中的主要作用是防止液体介质对流混合从而确保分离后的各区带不受损害。具体方法还可以再分成两种:
    (1)速率区带离心法:在速率区带离心法中,当不同的颗粒间存在沉降系数差时(不需要像差速沉降离心法所要求的那样大的沉降系数差),在一定的离心力作用下,颗粒各自以一定的速度沉降,在惰性梯度介质的不同区域上形成区带。
    离心管先装好惰性梯度介质溶液,样品液加在梯度介质的液面上,离心时,由于离心力的作用,颗粒离开原样品层,按不同沉降速度向管底沉降,离心一定时间后,沉降的颗粒逐渐分开,最后形成一系列界面清楚的不连续区带,沉降系数越大,往下沉降越快,所呈现的区带也越低。离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结束,切忌无把握的延长离心时间,否则那些S值较小但ρ值较大的颗粒随着时间的延长将后来者居上,尤其是那些密度相近而沉降系数相远的颗粒将有机会集合在同一个等密度区带内,反而影响纯化分离。可见选准离心时间是本法的关键环节之一。此法分离过程如图2所示。
   
     (2)等密度离心法:等密度离心法也叫ρ区带分离法,本法是使不同密度的各种颗粒分别停留在介质的相应密度梯度上,形成一条ρ=ρ0的等密度区带,从而达到分离的目的,故又称为ρ区带分离法。这种方法仅与颗粒的密度有关而与其大小、形状、S值等无关。离心时样品可以加到任何位置上。离心时间宜长不宜短。介质可以采用连续梯度,也可以采用不连续梯度。采用连续梯度时,这个密度梯度应包括所要分离的各种颗粒的密度范围。于是各不同密度的颗粒(ρ1、ρ2、ρ3…… )在离心时将分别沉降在与介质相应的密度区带位置上,各颗粒将按各自密度的大小依次排列成一条条的样品带而达到分离的目的[2]。此法分离过程如图3所示。
   
    超速离心机工作速度范围广泛,可处理多种样品,是科研实验中不可或缺的实验手段,广泛应用于生物大分子、细胞器、细胞、病毒等的分离纯化。经离心纯化可直接获得有关细胞或细胞器、病毒、生物大分子的相关信息,为进一步研究其生物学特性奠定基础[3]。离心分离提纯某种颗粒时,可参考前人的经验,同时,根据要分离颗粒的性质和所具有的离心条件及提纯要求选用不同的离心方案。在设计离心方案时,首先选择合适的梯度材料,应考虑其溶液的最大密度范围是否合适,所选用的物质是否影响样品的活性,对转头和离心管是否有腐蚀作用等。其次选择合适的离心方式,由于生物颗粒的沉降系数有一定的范围,有时可根据其沉降系数或浮密度来分离某种颗粒,但为了得到最好的效果,往往必须同时考虑这两个特性,结合不同的离心技术进行分离。最后选择合适的转头,差速离心选用角转头最有效,速率区带离心最好使用水平转头,等密度梯度离心可以用角转头或者水平转头。值得注意的是,转头对重盐梯度的最大允许速度,由于转头的最大速度是根据离心管所装溶液的密度计算的,如果该溶液密度超过此速度,则应相应降低最大允许速度。不同转头的最大允许速度及具体减速数值在转头说明书中皆有图表说明。总之,在使用超速离心机时,除了设计科学合理的离心方案,还应严格按说明操作,并定期维护离心机及其部件,以充分发挥离心机的利用效率,满足相关专业学科的实验需求。
参考文献
[1]陈仕均,唐海蓉,张兆沛,等.离心机的原理、操作及维护〔J〕.现代科学仪器,2010,3:151-154.
[2]金绿松,林元喜.现代分离科学与技术丛书:离心分离〔M〕.北京:化学工业出版社,2008:243-256.
[3]付政祺,杨莹,田青.蔗糖梯度离心技术方法在提取内质网的应用〔J〕.医学理论与实践,2011,24(17):2022-2024.(编辑 紫苏)